助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响

摘要目的研究助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响。 方法 育龄期妇女90例 (24-36岁)，随机分为自然周期组、西药组(克罗米芬+绒毛膜促性腺激素)、中西药结合（西药组+中药组）和中药组(助孕汤)。随访三个月，统计妊娠率、超声观察子宫内膜厚度和类型、逆转录PCR和免疫组化分别检测子宫内膜雌孕激素受体(ER、PR)、整合素β3 mRNA和蛋白水平。结果 与自然周期组相比，妊娠率在中西药结合、中药组有所上升而在西药组有所下降，但无显著性差异。与自然周期组和中西药结合组相比，子宫内膜厚度、ER、PR mRNA和蛋白水平在西药组显著下降而在中药组则显著上升。结论 助孕汤通过调节子宫内膜厚度、增加子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA和蛋白水平来改善妊娠率，并能拮抗克罗米芬降低子宫内膜容受性的副作用。

关键词助孕汤；子宫容受性；雌、孕激素受体；整合素β3

Effect of Zhu Yun Tang on the endometrial receptivity of women in periovulatory period

Abstract Objective To investigate the effect of Zhu Yun Tang on the endometrial receptivity of women in periovulatory period. Methods Ninety women (age ranging from 24 to 36 years) in periovulatory period were enrolled during the year 2004-2007 and randomly divided into four groups: normal period group (control), pure western drug group ( clomiphene + human chorionic gonadotrophin), pure traditional Chinese medicine group ( Zhu Yun Tang), combined western and traditional Chinese medicine group. After 3-month follow up, the pregnancy ratio was recorded, the thickness and type of endometrium was measured by ultrasound and the messenger RNA and protein levels of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and integrin beta 3 were determined by reverse PCR and immunohistochemistry methods, respectively. Results Compared with normal period group, the pregnancy rate of patients was increased from combined western and traditional Chinese medicine group and pure traditional Chinese medicine group but decreased from pure western drug group without significant difference. Besides, compared with normal period group and combined western and traditional Chinese medicine group, patients from pure western drug group had significantly decreased thickness of endometrium and messenger RNA and protein levels of ER, PR. However, patients from traditional Chinese medicine group had significantly increased messenger RNA and protein levels of ER, PR and integrin beta 3. Conclusion Zhu Yun Tang could ameliorate women pregnancy rate by increasing the thickness of endometrium and the messenger RNA and protein levels of ER, PR and integrin beta 3 as well as antagonize the impairment of endometrium by clomiphene.

Keywords Zhu Yun Tang, endometrial receptivity, estrogen receptor, progesterone receptor, integrin beta 3

不孕症的发病率逐年上升，最新统计已占育龄妇女的15%, 成为仅次于心血管疾病和肿瘤的第三大疾病(1)。随着人工助孕技术（IVF-ET）的发展，临床上已经能应用促排卵药物取得较多的卵泡发育和较高的排卵率，但促排卵后的妊娠率较低（20％～30％）仍是未能解决的问题。一方面，这与促排卵后卵细胞的质量密切相关；另一方面，胚泡着床障碍起到主导作用，而子宫内膜容受性差又是后者的主要原因之一(2)。因此，改善子宫内膜容受性，提高着床率是提高人工助孕技术成功率的关键。

助孕汤系我院国家级名老中医鲍严钟所创制的有效复方，由当归、黄芪、鹿角片、淫羊藿、巴戟天、葫芦巴、补骨脂、菟丝子、丹参等组成。我们在10年的临床应用中观察发现，助孕汤单独应用或配合克罗米芬可以显著改善卵泡发育，诱导排卵，提高着床率，但机理不明，我们推测可能与促进子宫内膜容受性有关。为探讨助孕汤促进胚泡着床的作用机制，本研究拟通过观察并比较对照组和实验组的子宫内膜厚度、大体形态、雌孕激素受体(ER、PR)和整合素β3表达的变化，进一步研究助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响，以期为中药的临床疗效寻找分子作用机制。

选择2004年12月~2007年6月因男性不育欲行人工授精而就诊于本院生殖中心的妇女90例，年龄24~36岁，不育年龄1.5~6年，其中原发不育63例，继发不育27例。纳入标准如下：①女性，40岁以下，育龄妇女婚后有正常性生活，未避孕同居一年未能受孕，或曾有妊娠史而又1年未能再孕，经检查诊断为男方不育而行人工授精者；②月经周期正常，基础体温双相；③基础内分泌正常；④近三个月未服用激素治疗；⑤B超检查子宫、卵巢无器质性病变；⑥经输卵管造影证实双侧输卵管通畅；⑦排除免疫性不孕。入选病例随机分为四组：自然周期组30例，西药组20例，中西药结合组20例，中药组20例。组间年龄、身高、体重无显著差异。

1，治疗方法

自然周期组不给任何药物。西药组给予克罗米芬+绒毛膜促性腺激素：月经周期第5天起口服CC100mg，共5天，当优势卵泡直径≥1.8cm时，肌肉注射HCG10000U。中西药结合组给予克罗米芬+绒毛膜促性腺激素+助孕汤：月经周期第5天起西药同上组，加服助孕汤 (由浙江中医学院提供道地药材，最终制成含2g/ ml助孕汤提取液)，1次50ml，1天2次口服，至排卵后10天。中药组给予助孕汤：月经周期第5天起，服助孕汤，1次50ml，1天2次口服至排卵后10天。因本实验中取子宫内膜是有创性检查，所以各组均为为一个疗程（即一个月经周期）。

2检查方法及观察指标

2.1观察子宫内膜厚度、形态

自排卵日算起第七天，采用东芝SAL-77A型阴道超声（TVS）,探头频率为5.0MHz，距宫底2.0cm测量冠状面子宫内膜厚度（前后壁内膜与子宫肌层交界处强回声内膜厚度）。子宫内膜形态按Gonen标准分为A型：典型三线型或多层子宫内膜，外层和中央为强回声线，外层和宫腔中线之间为低回声区或暗区；B型：均一的中等回声型，宫腔强回声中线断续不清；C型：均质型回声，无宫腔中线回声。

2.2逆转录PCR检测子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平

自排卵日算起第七天，采用Trizol法提取子宫内膜总mRNA，在核酸分析仪上检测RNA的含量并常规行琼脂糖电泳检测RNA是否降解。按照逆转录试剂盒提供的实验步骤反转录mRNA成cDNA。Trizol RNA抽提试剂、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶及缓冲液、MLV逆转录酶及缓冲液、dNTPs、OligodT18、RNase抑制剂等均购自大连宝生物工程有限公司。PCR引物使用prier premier 5.0 软件设计后由上海英骏生物技术有限公司合成序列如下(a) ER: 上游：5’- ATGGAGTCTGGTCCTGTGAGG -3’; 下游：5’- GCTGTTCTTCTTAGAGCGT TTGA-3’ (326 bp); (b) PR: 上游： 5’- TTCCAAATGAAAGCCAAGCC-3’; 下游: 5’-AAGTTGATAGAAACGCTGTGA GC-3’ (635 bp); (c); 整合素β3:上游： 5’- GCAAGATCACGGGCAAGTAC-3’; 下游: 5’- AGGACCACCAGGATGTCAGG- 3’ (550 bp)。

PCR反应物的量如下：1ul cDNA, 2ul 10 x buffer, 2ul 2 mol/L dNTP, 2ul 10umol/L 正向和反向引物, 1ul 10mmol/L Mgcl2, 0.5ul Taq 酶，补水至总体积20ul，分别进入PCR循环。由于通过软件设计的引物退火温度均在58℃左右，故ER、PR、整合素β3的PCR循环条件均设为：98℃变性10s,58℃退火30s，72℃延伸1min。共进行30个循环，循环结束后72℃以5min终止反应。取PCR产物10ul，加入1ul 10x loading buffer后用1%琼脂糖行DNA电泳，电泳条带结果用VDS图像分析系统分析。以ER、PR、整合素β3的吸光度与β-actin(看家基因，PCR常规引物扩增)吸光度的比值，表示相应物质mRNA的表达水平

2.3免疫组化法测子宫内膜ER、PR、整合素β3蛋白水平

在排卵后7～8天用Piptte管吸取子宫内膜组织，常规石蜡包埋切片后采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法进行检测。单克隆鼠抗人ER、PR和整合素β3抗体均购自美国Santa Cruz公司。根据试剂附带说明书ER、PR定位于细胞核而整合素β3定位于细胞浆，将SP染色切片置于CHK型号Olympus显微镜400×下观察，选择5个视野，每个视野记数100个细胞，分别读出其中阴性（－）即细胞核内无棕色颗粒；弱阳性（＋）即细胞核内有较浅的棕色颗粒；阳性（＋＋）即细胞核内有棕色颗粒清晰；强阳性（＋＋＋）即细胞核内有明显棕色颗粒的细胞数。再用组织学积分H-score方法进行半定量分析(三个对标本分类未知的临床医生进行)。计算公式：H-score＝∑pi(i+1)。其中Pi代表同一染色强度的阳性细胞数占待测细胞总数的百分比，即Pi＝阳性细胞数/待测细胞总数×100％。Ⅰ为染色强度，用1、2、3分别代表（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）。1为纠正系数。

3 统计学方法

采用SPSS11.0进行统计分析，其中计量资料用“ ±s”表示，多组间比较用方差检验，两组间比较用t检验；记数资料采用卡方检验。p0.05为统计学上有显著性差异。本研究经过本院医学伦理委员会批准。

3.1四组患者当月妊娠率和子宫内膜厚度、类型比较

与自然周期组比较，西药组患者的妊娠率下降最明显而中西医结合组则升高幅度最大；同时，西药组患者的子宫内膜厚度比自然周期组也有显著性下降(p0.05)，而中药组、中西医结合组与自然周期组无显著性差异，但比西药组有显著性升高(p0.05)。此外，内膜类型除西药组以C型为主外，其他三组均以A、B型为主(表1)。

*, 与自然周期组比较，p0.05; **, 与西药组比较，p0.05; ^ , 与西药组比较，p0.05

3.2 四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平变化

经1%琼脂糖凝胶电泳分析，ER mRNA、PR mRNA、整合素β3 mRNA、β-actin mRNA的扩增产物和理论长度一致。由表2及图1可知，与自然周期组相比，西药组患者子宫内膜ER、PR mRNA水平显著下降(p0.05), 而整合素β3 mRNA无明显差异；而中西医结合组与自然周期组比较无显著性差异，但比西药组有显著性升高(p0.05)。对中药组而言，其ER、PR 及整合素β3 mRNA水平比自然周期组亦有显著性增高(p0.05,)。

表2，四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平变化

*, 与自然周期组比较，p0.05; **, 与西药组比较，p0.05; ^ , 与自然周期组组比较，p0.05

3.3，四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 蛋白水平变化

ER、PR 及整合素β3阳性效应产物呈棕黄色颗粒，前二者主要分布于腺体细胞核而整合素β3则主要定位于腺体细胞膜和胞浆中(图2)。由H-score方法进行半定量分析可知：与自然周期组相比，西药组患者子宫内膜ER、PR 蛋白水平显著下降(p0.05), 而整合素β3 蛋白水平无明显差异；而中西医结合组与自然周期组比较无显著性差异，但比西药组有显著性升高(p0.05)。对中药组而言，其ER、PR 及整合素β3蛋白水平比自然周期组亦有显著性增高(p0.05, 表3)。

*, 与自然周期组比较，p0.05; **, 与西药组比较，p0.05; c , 与自然周期组组比较，p0.05

胚泡着床是其与子宫内膜相互作用的过程，而后者只有在特定的时期(即“种植窗”)内才允许胚泡着床，因而子宫内膜容受性是影响胚胎着床的主要因素之一(3)。子宫内膜是卵巢甾体激素的主要靶器官，也是雌孕激素发挥作用最直接的器官，两者协同调节胚胎着床前子宫内膜的容受状态。而最近的研究还提示，子宫内膜雌孕激素受体及整合素β3的表达也影响了子宫内膜容受性(4)。当前对于排卵障碍性不孕不育，国内外较多采用克罗米芬及性激素治疗，但此类药物在受体水平上阻断了雌激素作用，导致子宫内膜DNA合成受阻，使得内膜发育迟缓，呈现高排卵率、低妊娠率的特点(5, 6)。我们的研究发现，使用西药组患者的妊娠率为5%，比自然周期组10%要低，而使用中西药结合组和中药组的妊娠率分别上升到20%和15%。由于纳入实验的人数有限并且妊娠率的统计是在实验结束后3个月后进行，因而本次实验的妊娠率偏低且组间的差异只是种趋势，在进行卡方检验时无显著性差异。但后续研究发现，与自然周期组相比，西药组患者的子宫内膜厚度显著下降，这与之前的研究克罗米芬等促排卵药物影响子宫内膜厚度从而影响妊娠率相符；而中西药结合组则能显著拮抗促排卵药的这种副作用。此外，子宫内膜类型当呈现典型“三线征”即A型时，其处在最佳的容受状态，而B型、C型的子宫容受性则依次递减。从表1可知，西药组A型子宫内膜占20%，与中药组的75%相比有显著性差异(X2=12.13, p0.05)；而西药组A＋B型子宫内膜占55%，与中西药结合组的85%相比亦有显著性降低(X2=4.29, p0.05)。上述子宫内膜形态学的阳性结果从形态学的角度提示助孕汤能改善子宫内膜容受性，拮抗克罗米芬等促排卵药对子宫内膜造成的损害。

除了上述的形态学指标，我们还深入研究了助孕汤影响子宫内膜容受性的可能分子机理，从mRNA和蛋白水平揭示了子宫内膜ER、PR、整合素β3在其中的作用，现分述如下：雌孕激素的生理效应有赖于ER、PR的介导，因而后者表达失常均将导致着床失败(7)；既往对不孕女性子宫内膜ER、PR水平的研究显示内膜异常组ER显著低于正常组，提示ER异常在影响子宫内膜容受性中的作用(8)。我们的结果也证实与自然周期组相比，助孕汤能显著增加ER、PR mRNA和蛋白的表达水平并且拮抗克罗米芬等促排卵药所导致的ER、PR表达下降。整合素β3是一类细胞黏附分子，由α、β两亚单位以非共价键形式连成异二聚体分子构成(9)。它可作为子宫内膜容受性的标志分子，其表达受到激素、细胞因子、胚胎因素等多种信号的调节，并且通过识别配体发挥作用(10)。我们的研究发现与自然周期组比较，西药组患者整合素β3 mRNA和蛋白水平无显著性降低，这与Gonzalez RR等观察到的克罗米芬对不明原因不孕患者种植窗口期的整合素β3表达无影响相一致(11)。但中药组患者整合素β3 mRNA和蛋白水平与自然周期组比较有显著性增高。ER、PR、整合素β3的阳性结果提示助孕汤可能通过作用于这些分子，一方面拮抗克罗米芬等促排卵药导致子宫内膜容受性降低的副作用，另一方面自身就具有提高子宫内膜容受性进而增加妊娠率的作用。但是，受体内实验的限制，我们无法研究助孕汤是直接还是间接作用于上述分子；此外，与其他中药研究所面临的问题一样，助孕汤作为一味复方试剂，我们无法研究上述作用是来自于具体哪味药还是多种药物的加成。这些问题有待于在将来更加严谨的随机对照双盲实验中来解决。

从中医药的角度，助孕汤改善妊娠期妇女子宫内膜容受性也是具有理论依据的。该方剂的主要作用是补肾温阳，养血活血。中医认为肾主生殖，主藏精；肾精之血，冲任直接参与生育的生理活动，补肾养血药调节“肾——天葵——冲任——胞宫”轴。方中淫羊藿、葫芦巴温肾助阳，调节冲任，促进性腺功能，提高卵巢、子宫重量及垂体重量增加；鹿角片温阳暖宫，促使卵泡发育，改善黄体功能；何首乌、当归、熟地补肾养血，可抑制血管内血栓形成；丹参活血，具有使子宫内膜螺旋动脉变粗、变长、增加子宫内膜血流灌注量大，使得内膜增厚，为受精卵着床做好准备(12)。

综上，我们的实验再次证实了克罗米芬能降低子宫内膜厚度、减少ER、PR mRNA和蛋白表达，从而损害妊娠期妇女子宫内膜容受性并影响妊娠。我们首次发现助孕汤能拮抗上述作用，并且单独使用助孕汤能增加妊娠率，这可能与其能改善子宫内膜类型并增加子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA和蛋白表达相关。由于克罗米芬具有显著的促排卵作用，我们建议在临床上将其与助孕汤合用，以助孕汤能改善子宫内膜容受性之长，补克罗米芬降低子宫内膜容受性之短。我们的研究结果代表了中医从宏观上协调机体内分泌环境与西医助孕技术微观治疗相结合的模式，为中药与人工助孕技术相结合从而提高不孕症治疗成功率提供了实验依据；为中西医结合治疗不孕症提供了新方法。

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